El análisis combinado del proteoma y el metaboloma proporciona información sobre el microARN

Aug 02, 2023

Parásitos y vectores volumen 16, número de artículo: 271 (2023) Citar este artículo

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Los virus patógenos pueden ser transmitidos por mosquitos hembra Aedes aegypti (Ae. aegypti) durante la adquisición de sangre de vertebrados. El silenciamiento del microARN (miARN) 1174 (miR-1174) específico de los mosquitos y del intestino medio perjudica la ingesta de sangre y aumenta la mortalidad. La determinación de la identidad de las proteínas y metabolitos que responden al agotamiento de miR-1174 aumentará nuestra comprensión de los mecanismos moleculares de este miARN en el control de la alimentación sanguínea y el metabolismo de los nutrientes de los mosquitos.

Se inyectaron oligonucleótidos antisentido (antagomirs [Ant]) Ant-1174 y Ant-Ct en hembras de Ae. aegypti a las 12-20 h después del cierre, y el agotamiento de miR-1174 se confirmó mediante PCR cuantitativa en tiempo real con transcripción inversa (RT-qPCR). Los mosquitos inyectados con Ant-1174 y los de control se recolectaron antes de la ingesta de sangre a las 72 h después de la inyección para el análisis proteómico basado en etiquetas de masa en tándem y el análisis metabolómico no objetivo de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem para identificar proteínas y metabolitos expresados ​​diferencialmente, respectivamente. Se aplicó la interferencia de ARN (ARNi) mediante inyección de ARN bicatenario (ARNds) para investigar las funciones biológicas de estos genes expresados ​​diferencialmente. El efecto de ARNi se verificó mediante RT-qPCR y ensayos de transferencia Western. El contenido de triglicéridos y los niveles de ATP se midieron utilizando los kits de ensayo adecuados, siguiendo las instrucciones del fabricante. Los análisis estadísticos se realizaron con el software GraphPad7 utilizando la prueba t de Student.

Tras el agotamiento de miR-1174 específico de mosquitos y intestino medio, se identificaron un total de 383 proteínas expresadas diferencialmente (DEP), entre las cuales 258 estaban reguladas al alza y 125 a la baja. El análisis funcional de estos DEP utilizando el enriquecimiento de Gene Ontology (GO) y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) sugirió que miR-1174 desempeña importantes funciones reguladoras en el metabolismo de los aminoácidos, el metabolismo de los nucleótidos, el metabolismo de los ácidos grasos y las vías del metabolismo del azúcar. Se identificaron un total de 292 metabolitos diferenciales, de los cuales 141 estaban regulados al alza y 151 a la baja. El análisis integrativo mostró que las proteínas y metabolitos diferenciales asociados se enriquecieron principalmente en una variedad de vías metabólicas, incluida la glucólisis, el ciclo del citrato, la fosforilación oxidativa y el metabolismo de los aminoácidos. Específicamente, el gen de una proteína regulada positivamente en mosquitos empobrecidos en miR-1174, la purina nucleósido fosforilasa (PNP; AAEL002269), se asoció con las vías metabólicas de purina, pirimidina y niacina-nicotinamida. La caída de PNP inhibió gravemente la digestión de la sangre y el desarrollo de los ovarios y aumentó la mortalidad adulta. Mecánicamente, el agotamiento de PNP condujo a una regulación negativa significativa del gen de la vitelogenina (Vg); Además, se vieron afectados algunos genes importantes en las vías de señalización de ecdisona y de péptidos similares a la insulina relacionados con el desarrollo de los ovarios.

Este estudio demuestra la acumulación diferencial de proteínas y metabolitos en Ae. empobrecido en miR-1174. mosquitos aegypti mediante técnicas proteómicas y metabolómicas. Los resultados proporcionan evidencia funcional del papel del gen PNP regulado positivamente en las actividades fisiológicas del intestino. Nuestros hallazgos resaltan cambios moleculares clave en Ae empobrecido en miR-1174. aegypti y, por lo tanto, proporcionan una base y conocimientos novedosos para una mayor comprensión del mecanismo molecular involucrado en un miARN específico de linaje en los mosquitos vectores.

Las hembras de especies de mosquitos vectores extraen sangre de vertebrados para obtener los aminoácidos y otros nutrientes necesarios para el desarrollo de los huevos; en consecuencia, sirven como vectores de una gran cantidad de patógenos virales. Con la urbanización global y el continuo calentamiento del clima, el riesgo de enfermedades transmitidas por mosquitos está aumentando en todo el mundo, lo que plantea un grave desafío para la salud pública e impone importantes cargas económicas a muchos países [1]. En los últimos años, han ido ganando aceptación una serie de estrategias y tecnologías prometedoras para el control de mosquitos vectores basadas en la manipulación genética [2,3,4,5]. Sin embargo, la falta de intervenciones médicas eficaces todavía restringe la prevención y el control de la mayoría de las enfermedades transmitidas por mosquitos.

Comprender las vías reguladoras del metabolismo de los nutrientes de los mosquitos vectores es fundamental para la prevención y el control de las enfermedades virales transmitidas por mosquitos. En el mosquito hembra, las principales vías del metabolismo de los carbohidratos están sincronizadas con las altas demandas energéticas de la reproducción [6]. Los aminoácidos y proteínas de la sangre de los vertebrados absorbidos por los mosquitos proporcionan los nutrientes necesarios para el desarrollo de los ovarios. Por tanto, un metabolismo normal de los aminoácidos es fundamental para la reproducción de los mosquitos.

En estudios anteriores, demostramos que el microARN (miARN) -1174 (miR-1174) específico de mosquitos y intestinos controla la utilización del azúcar, la absorción de sangre, el desarrollo de los ovarios y la deposición de óvulos a través de su gen objetivo serina hidroximetiltransferasa (SHMT) [7]. También descubrimos que la eliminación de SHMT no afecta la absorción de sangre de los mosquitos, pero sí bloquea la digestión de la sangre, de modo que los mosquitos pierden la capacidad de volar, el desarrollo de los ovarios se estanca y la tasa de desove se reduce [8]. La proteína SHMT cataliza la conversión cruzada de l-serina y glicina [9, 10]. La biosíntesis de purinas y pirimidinas se inhibe cuando se reduce la actividad de SHMT [11]. Aunque el eje miR-1174-SHMT desempeña funciones importantes en el intestino de los mosquitos, los mecanismos moleculares de acción de miR-1174 en procesos fisiológicos como la digestión de la sangre, la homeostasis metabólica y la reproducción siguen siendo en gran medida desconocidos.

Llevamos a cabo el presente estudio para descifrar las vías de respuesta de miR-1174 involucradas en los procesos biológicos de los mosquitos mediante el uso de técnicas proteómicas y metabolómicas. Analizamos las funciones de las proteínas y metabolitos expresados ​​diferencialmente utilizando el enriquecimiento de Gene Ontology (GO) y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Se realizó la integración de proteómica y metabolómica para identificar las vías de señal para aquellas proteínas y metabolitos expresados ​​diferencialmente. Las funciones biológicas de estos genes que responden a miR-1174 se investigaron mediante ARN de interferencia (ARNi). Específicamente, la desactivación del gen que codifica la purina nucleósido fosforilasa (PNP) inhibió gravemente la digestión de la sangre y el desarrollo de los ovarios y acortó la longevidad de los mosquitos adultos. Nuestro trabajo amplía y profundiza aún más el conocimiento actual sobre el mecanismo regulador del miR-1174 específico para mosquitos y puede proporcionar un nuevo objetivo para el desarrollo de técnicas novedosas para el control de mosquitos a nivel molecular.

Ae. Los mosquitos aegypti (cepa NIH Rockefeller) utilizados en este estudio fueron criados como se informó anteriormente [8]. Brevemente, el Ae. La colonia de la cepa aegypti se crió a 28 °C y 75% de humedad relativa bajo un fotoperíodo de luz/oscuridad de 12/12 h. Las larvas se criaron en agua suplementada con una dieta artificial compuesta de levadura y comida para ratas (proporción 1:1). Se proporcionó a los mosquitos adultos un algodón empapado en agua y un algodón empapado en una solución de glucosa al 10% antes y después de ingerir sangre. Se permitió que mosquitos hembra de tres a cuatro días de edad se alimentaran de ratas blancas anestesiadas con isoflurano. Los animales vertebrados de laboratorio se mantuvieron de acuerdo con las pautas aprobadas por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Southwest. Para recolectar individuos y tejidos de mosquitos después de ingerir sangre, se extrajo el bolo de sangre del intestino pellizcándolo con unas pinzas bajo un estereomicroscopio. Los tejidos de mosquitos se diseccionaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Todos los experimentos de este trabajo se realizaron únicamente con mosquitos hembra adultos.

Los mosquitos, con o sin alimentación de sangre, fueron alimentados con una solución de glucosa al 10% en una incubadora de clima artificial mantenida a 28 °C y 75% de humedad relativa. Los oligonucleótidos antisentido (antagomirs [Ant]) Ant-1174 y Ant-Ct se adquirieron de Dharmacon Inc. (Lafayette, CO, EE. UU.) y se inyectaron en mosquitos hembra adultos entre 12 y 20 h después de la cierre (PE) como se describió anteriormente [7]. Se establecieron tres réplicas biológicas para los grupos inyectados con Ant-1174 (Ant-1174) y de control, con 60 mosquitos hembras y 30 machos en cada jaula. Las hembras inyectadas con Ant-1174 y los controles se recolectaron antes de una ingesta de sangre a las 72 h después de la inyección (PIJ), y 20 hembras seleccionadas al azar de cada jaula se colocaron en un tubo de centrífuga de 1,5 ml, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a − 80 ℃ antes de su uso. Se enviaron seis tubos Eppendorf (Eppendorf Co., Eppendorf, Hamburgo, Alemania) que contenían muestras (Ant-1174: control = 3:3) a Shanghai Biotree Biomedical Technology Co., Ltd. (Shanghai, China) para el análisis proteómico. La proteína total de cada muestra se extrajo, cuantificó, redujo, alquiló y digirió en péptidos. Los péptidos se marcaron con un kit de etiquetado de etiquetas de masa isobárica iodoTMTsixplex (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y luego se desalinizaron. Se transfirió una muestra de 2 µg de péptidos marcados con TMT6 utilizando una cromatografía líquida de nano-ultra alto rendimiento (UHPLC) acoplada a un instrumento Q Exactive HFX Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) equipado con una fuente de iones de nano-electropulverización. Los datos de espectrometría de masas obtenidos se introdujeron en el software Proteome Discoverer (PD) (versión 1.4.0.288; Thermo Fisher Scientific) para su detección. Los parámetros de detección se establecieron de la siguiente manera: rango de masa del ion original: 400–5000 Da; número mínimo de picos en el espectro de masas secundario: 10; Umbral de relación señal-ruido (S/N): 1,5. Se buscó adicionalmente en el espectro de masas obtenido de la detección de EP utilizando el motor de búsqueda del software Mascot (versión 2.3.2), seguido de análisis cualitativos y cuantitativos basados ​​en la base de datos UniProt [12]. Los datos originales incluyeron 5892 proteínas extraídas de seis muestras experimentales (archivo adicional 1: Tabla S1), de las cuales 5875 proteínas se retuvieron después del tratamiento previo (archivo adicional 2: Tabla S2). Los DEP se seleccionaron de acuerdo con los siguientes criterios: valor de p <0,05 y cambio de veces <0,83 o> 1,2, como se describe en otros estudios [13,14,15,16] (archivo adicional 3: Tabla S3). Los DEP se sometieron a análisis de enriquecimiento de GO [17] y de enriquecimiento de la vía KEGG [18].

Se inyectaron Ant-1174 y Ant-Ct en los mosquitos adultos hembra como se describió anteriormente para el análisis proteómico. También se recolectaron mosquitos hembra antes de ingerir sangre a las 72 h PIJ. Tanto el grupo inyectado con Ant-1174 (Ant-1174) como el grupo de control contenían ocho réplicas biológicas con 30 mosquitos hembra en cada grupo, lo que produjo 16 tubos Eppendorf de muestras preparadas para cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) no objetivo. metabolómica. Todas las muestras recolectadas se congelaron en nitrógeno líquido, se envolvieron en hielo seco y se enviaron a Shanghai Biotree Biotechnology Co., Ltd. para los análisis LC-MS/MS. Para extraer los metabolitos, se pesaron 50 mg de cada muestra en un tubo Eppendorf que contenía 1000 µl de solución de extracto (acetonitrilo:metanol:agua = 2:2:1, con una mezcla de estándar interno marcada con isótopos). Una mezcla de una alícuota igual de los sobrenadantes de todas las muestras sirvió como muestra de control de calidad (QC). Todas las muestras se analizaron en un sistema UHPLC Vanquish (Thermo Fisher Scientific) con una columna UPLC BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm) acoplada a un espectrómetro de masas Q Exactive HFX (Thermo Fisher Scientific). Adoptamos tanto el modo de iones positivos (POS) como el modo de iones negativos (NEG) en la fuente de ionización QE del sistema de ionización por electropulverización (ESI). La fase móvil A consistía en acetato de amonio 25 mM/l o hidróxido de amonio 25 mM/l en agua (pH = 9,75) para los modos POS y NEG, respectivamente. La fase móvil B fue acetonitrilo para ambos modos. El gradiente de elución para el análisis se estableció de la siguiente manera: 0–0,5 min, 95% B; 0,5 a 7,0 min, 95 a 65 % B; 7,0 a 8,0 min, 65 a 40 % B; 8,0 a 9,0 min, 40 % B; 9,0 a 9,1 min, 40 a 95 % B; 9,1–12,0 min, 95 % B. La temperatura de la columna fue de 30 °C; la temperatura del automuestreador fue de 4 °C; y el volumen de inyección fue de 2 μl. Se utilizó el espectrómetro de masas AQ Exactive HFX para evaluar los espectros MS/MS en el modo de adquisición dependiente de la información bajo el control del software de adquisición Xcalibur (Thermo Fisher Scientific). Las condiciones de la fuente ESI se establecieron de la siguiente manera: caudal de gas envolvente: 50 Arb; Caudal de gas auxiliar: 10 Arb; temperatura capilar: 320 °C; resolución completa de MS: 60.000; Resolución MS/MS: 7500; energía de colisión: 30/10/60 en modo NCE; voltaje de pulverización: 3,5 kV (positivo) o − 3,2 kV (negativo).

Los datos brutos de metabolómica descritos anteriormente se convirtieron al formato mzXML utilizando el software ProteoWizard [19] y luego se procesaron con el programa XCMS del paquete R XCMS (v3.5) [19], seguido de pretratamientos de picos que incluyen detección, extracción, alineación e integración. Los picos restantes se anotaron en comparación con los índices de tiempo de retención y relación masa-carga (m/z) en las bases de datos en línea HMDB (https://hmdb.ca/) [20] y KEGG (http://www. .genome.jp/kegg), así como en la base de datos interna MS2 (Biotree DB). El límite para la anotación se fijó en 0,3. En el modo POS, se extrajeron 7003 picos de tres muestras de control de calidad y 16 muestras experimentales, y se retuvieron 5714 picos después del tratamiento previo (archivo adicional 4: Tabla S4). En el modo NEG, se extrajeron 7179 picos de tres muestras de control de calidad y 16 muestras experimentales, y se retuvieron 5609 picos después del tratamiento previo (archivo adicional 5: Tabla S5). En total, se extrajeron 14.113 picos de los modos POS y NEG combinados, y se retuvieron 11.270 picos después del tratamiento previo (archivo adicional 6: Tabla S6). Los datos de los modos POS y NEG finalmente se fusionaron en el análisis de datos posterior.

Se llevó a cabo un análisis de componentes principales (PCA) [21], un análisis no supervisado que reduce las dimensiones de los datos, para visualizar la distribución y la agrupación de las muestras. Se utilizó un intervalo de confianza (IC) del 95% (elipse T cuadrada de Hotelling) en el gráfico de puntuación PCA como umbral para identificar posibles valores atípicos en el conjunto de datos. Se aplicó el análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales (OPLS-DA) [22, 23] para visualizar aún más la separación del grupo e identificar metabolitos significativamente modificados. Los metabolitos con importancia variable en la proyección (VIP) > 1 y P <0,05 (pruebas t de Student bilaterales no apareadas) en el modelo OPLS-DA se consideraron metabolitos expresados ​​diferencialmente (DEM). Se trazaron gráficos de volcanes y un mapa de calor agrupado jerárquicamente para visualizar características significativas de los DEM identificados. Se utilizaron bases de datos comerciales, incluidas KEGG (//www.genome.jp/kegg/) y MetaboAnalyst 5.0 (//www.metaboanalyst.ca/), para el análisis de enriquecimiento de vías. Finalmente, se realizó un análisis integrado del proteoma y metaboloma para las proteínas y metabolitos diferenciales.

Descargamos las regiones 3' no traducidas (3'-UTR) de Ae. aegypti de VectorBase (https://vectorbase.org/vectorbase/app) y predijo los objetivos candidatos de miR-1174 utilizando RNAhybrid [24], miRanda [25], TargetScan [26] y Target Accessibility (PITA) [27]. Los objetivos candidatos previstos se cruzaron con las proteínas reguladas positivamente, dando como resultado los objetivos candidatos finales. Las 3′-UTR de estos genes objetivo candidatos se amplificaron mediante una rápida amplificación de los extremos del ADNc (3′-RACE) y se clonaron en el vector psiCHECK™-2 después de la digestión con las enzimas de restricción Not I y Xho I. El miR-1174 El imitador utilizado para la transfección celular se adquirió de Thermo Fisher Dharmacon (Thermo Fisher Scientific). Los tres genes diana candidatos finalmente se verificaron mediante un ensayo indicador de luciferasa dual en el sistema de detección múltiple GloMax® (Promega, Madison, WI, EE. UU.), como se describe en nuestro trabajo anterior [28]. La línea celular HEK-293T, el vector psiCHECK™-2 y los reactivos para el ensayo indicador de luciferasa dual (reactivo de ensayo de luciferasa Dual-Glo® y reactivo Dual-Glo® Stop & Glo®) se adquirieron de Promega.

El ARN total se extrajo utilizando el reactivo TRIzol (Life Technologies, Carisbad, CA, EE. UU.) siguiendo el manual del fabricante y luego se cuantificó utilizando un espectrofotómetro Nano 300 (Thermo Fisher Scientific). El ARN con una densidad óptica (DO) 260/280 > 1,8 se consideró satisfactorio para experimentos posteriores. La integridad del ARN extraído se comprobó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. Todos los pares de cebadores para la amplificación de genes por PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) se diseñaron utilizando el software Primer Premier 5.0 y luego se sintetizaron en Sangon Biotech (Shanghai, China) (archivo adicional 7: Tabla S7). Para examinar la expresión de los genes codificadores de proteínas, se transcribió de forma inversa 1 µg de ARN total en ADN complementario (ADNc) utilizando el sistema de síntesis de primera cadena SuperScript™ IV (TaKaRa Bio Inc., Otsu, Shiga, Japón). La RT-qPCR se realizó utilizando TB Green Premix Ex Taq TM II (Tli RNaseH Plus; TaKaRa Bio Inc.). El volumen de reacción (20 µl) contenía 10 µl de 2 × NovoStart® SYBR qPCR SuperMix Plus (Tiangen Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China), 0,8 µl de cebadores 10 µM, 0,4 µl de tinte ROX II, 2 µl de ADNc diluido. y 6,8 µl de ddH2O. La proteína ribosómica S7 (RPS7; AAEL009496-RA) sirvió como control interno. Las reacciones se realizaron en un sistema de PCR en tiempo real ABI7500 (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). El procedimiento de amplificación fue: pretratamiento a 95 °C durante 1 min; seguido de 40 ciclos de 95 °C por 1 min y 60 °C por 1 min; finalizando con la generación de las curvas de disolución a 95 °C por 15 s, 60 °C por 1 min y 95 °C por 15 s. Para examinar el nivel de expresión de miR-1174, se transcribió de forma inversa 1 µg de ARN total en ADNc utilizando SynScript® III miRNA RT SuperMix (TSK3001; Tsingke Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China). La RT-qPCR se realizó utilizando una mezcla de qPCR SYBR universal de miARN (TSE2001; Tsingke Biotechnology Co., Ltd.). El volumen total de reacción (20 µl) contenía 10 µl de miRNA Universal SYBR qPCR Mix (Tsingke Biotechnology Co., Ltd.), 0,8 µl de cebadores 10 µM, 0,4 µl de 50 × ROX Reference Dye II, 2 µl de ADNc diluido y 6,8 µl de ddH2O. Se utilizó ARN nuclear pequeño (snRNA) U6 (AAEL029000-RA) como control interno. Las reacciones se realizaron en el sistema de PCR en tiempo real ABI7500 (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific) utilizando el siguiente procedimiento de amplificación: pretratamiento a 95 °C durante 1 min; seguido de 40 ciclos de 95 °C por 10 s y 60 °C por 30 s; finalizando con la generación de las curvas de disolución a 95 °C por 15 s, 60 °C por 1 min y 95 °C por 15 s.

El ARN total se extrajo de mosquitos con reactivo TRIzol como se describe anteriormente. El ADNc de la primera cadena se generó utilizando el sistema de síntesis de primera cadena SuperScript™ IV (TaKaRa Bio Inc.). La PCR se realizó con la mezcla Platinum™ PCR SuperMix High Fidelity (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) según los siguientes procedimientos: 94 °C durante 2 min, 40 ciclos de 94 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y 68 °C. C durante 1 min; y una extensión final a 72 °C por 7 min. El ARN bicatenario (dsRNA) se sintetizó con un kit MEGAScript RNAi (Thermo Fisher Scientific) y luego se disolvió en agua libre de RNasa hasta una concentración de aproximadamente 1800 ng/μl. La calidad del ARNds se determinó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% y el ARNds que cumplía con los estándares se almacenó a -80 °C antes de su uso. A cada mosquito hembra se le inyectaron 0,5 µl de ARNbc aproximadamente a las 16 h PE. El ARNbc de proteína fluorescente verde mejorada (dsEGFP) en concentraciones similares a las del ARNbc de prueba sirvió como control. Tres días después de la inyección, se recolectaron hembras para la extracción de ARN total y el ensayo de RT-qPCR. Se utilizaron tres réplicas biológicas cada una para los grupos de tratamiento y control, con cinco mosquitos hembra en un tubo.

El vector de expresión pET-28a(+) se almacenó en nuestro laboratorio [8], y la cepa clonada Trans-T1 y la cepa de expresión BL21 se adquirieron de TransGen Biotech Co., Ltd. (Beijing, China). Para la síntesis de ADNc se utilizó el ARN total de mosquitos hembra adultos a las 72 h PIJ. Los cebadores con los sitios de restricción Not I y Nco I para la clonación de la secuencia codificante de PNP (CDS) se diseñaron utilizando el software Primer Premier 5.0 (archivo adicional 7: Tabla S7). La PCR se realizó utilizando PrimeStar HS ADN polimerasa (Takara Bio Inc.) de la siguiente manera: 94 °C durante 3 min; seguido de 25 ciclos de 94 °C 30 s, 65 °C 30 s y 72 °C 3 min; y 72°C por 10 min. Después de la verificación mediante digestión con doble enzima, el plásmido recombinante se transformó en la cepa de expresión BL21 para facilitar la expresión procariótica de PNP. Se añadió IPTG al 0,1% para la inducción y la mezcla se incubó a 37 °C durante 4 h. La proteína se purificó mediante cromatografía de afinidad en una columna de cromatografía unida a iones Ni2+ (General Electric Company, Boston, MA, EE. UU.) y se eluyó con imidazol a diferentes concentraciones (200 mM, 500 mM, 1 M, 2 M). La proteína purificada se dializó para eliminar el imidazol y finalmente se envió a Wuhan GeneCreate Biological Engineering Co., Ltd. (Wuhan, China) para la preparación del anticuerpo.

Los mosquitos se trituraron completamente en tampón de lisis RIPA (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, dodecilsulfato de sodio [SDS] al 0,1%, Triton X-100 al 1%, desoxicolato de sodio al 0,5% y libre de EDTA). inhibidor de proteasa ；Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) utilizando un molinillo homogeneizador eléctrico (TGrinder OSE-Y40; Tiangen Biotechnology Co., Ltd.). Las concentraciones de proteínas se evaluaron con el kit de ensayo BCA (Beyotime Biotechnology Co., Ltd.) en un lector de microplacas (Thermo Fisher Scientific). Para cada muestra, se mezclaron 40 ng de proteína total (lisado) con un quinto del volumen de tampón de carga de SDS 5X y luego se hirvieron en un baño de agua a 100 °C durante 10 minutos, seguido de la separación en electroforesis de SDS-poliacrilamida al 12% ( PAGE), transferencia de los productos de electroforesis sobre una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) y luego bloqueo de la membrana con leche desnatada al 5% a temperatura ambiente durante 2 h. El anticuerpo primario diluido con solución salina tamponada Tris 1X con tampón Tween 20 (TBST, pH 7,4) a 8000:1 se añadió a leche en polvo descremada al 1% preparada con TBST 1X y se incubó a 4 °C durante la noche o a temperatura ambiente durante 1h. Las transferencias se lavaron 3 veces con 1 × TBST durante 10 minutos cada una y luego se incubaron con 0,2 μg/ml de anticuerpo anti-conejo diluido con TBST a 10.000:1 durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego las transferencias se lavaron 6 veces con TBST 1X durante 10 minutos cada una. Se desarrollaron bandas específicas con un sustrato Clarity Western ECL y se detectaron utilizando ChemiDoc XRS (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.). El análisis densitométrico de las bandas de proteínas correspondientes al PNP se cuantificó con el software Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EE. UU.). La tubulina (AT819; Beyotime Biotechnology Co., Ltd.) sirvió como control de carga en experimentos de transferencia Western.

El contenido de triglicéridos (TG) se cuantificó utilizando el kit de ensayo colorimétrico de TG (n.º de catálogo: D799796-0100; Sangon Biotech, Shanghai, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se recolectaron los cuerpos grasos de ocho mosquitos hembra a las 36 h después de la ingesta de sangre (PBM) como una réplica biológica para dsPNP o dsEGFP, y se homogeneizaron completamente en 240 µl de tampón de lisis (mezcla de n-heptano e isopropanol en 1 :1 relación de volumen) con un homogeneizador eléctrico (TGrinder OSE-Y40; Tiangen Biotech Co., Ltd.), seguido de centrifugación a 12.000 g durante 15 min para eliminar la capa de grasa. Se transfirió una muestra de 120 µl del sobrenadante a un nuevo tubo Eppendorf de 1,5 ml y se trató secuencialmente con los reactivos 1 a 6 proporcionados en el kit de ensayo colorimétrico TG antes de medir el valor de absorbancia a 420 nm en el instrumento de ensayo (GloMax®-Multi). Instrumento YNERGY H4; Promega).

Los niveles de ATP se midieron utilizando el kit de ensayo de ATP (n.º de catálogo: S0026; Beyotime Biotechnology Co., Ltd.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, los cuerpos grasos de ocho mosquitos hembra a las 36 h PBM se agruparon en un tubo Eppendorf de 1,5 ml como una réplica biológica, seguido de trituración en 120 µl de lisado con un homogeneizador eléctrico (TGrinder OSE-Y40; Tiangen Biotech Co., Limitado.). Después de la centrifugación a 16.000 g durante 5 minutos a 4 °C, el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo Eppendorf de 1,5 ml y se agregaron 100 µl del reactivo de detección de ATP diluido a cada pocillo en una placa de 96 pocillos. La placa se mantuvo a temperatura ambiente durante 3 a 5 minutos para que el ATP de fondo se consumiera en la reacción. Luego, se agregaron 20 μl de la muestra sobrenadante o muestra estándar a cada pocillo, se mezclaron rápidamente y se mantuvieron a temperatura ambiente durante al menos 2 s, después de lo cual se midió la unidad de luz relativa (RLU) mediante un lector ELISA (GloMax®-Multi Instrumento; Promega). El contenido de ATP en cada muestra se calculó en la curva estándar, que se generó mediante los siguientes gradientes de concentración de solución estándar de ATP: 0,1 µM, 0,15 µM, 0,3 µM, 0,65 µM, 1,5 µM y 3 µM. Todos los valores se normalizaron con respecto al grupo de control.

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE. UU.) y los valores se presentaron como la media ± error estándar de la media (SEM). Los experimentos se repitieron al menos tres veces y cada experimento incluyó al menos tres tratamientos. Las barras de error se generaron a partir de réplicas experimentales. El valor del umbral del ciclo medio (Ct) se convirtió al nivel de expresión relativo utilizando el método 2-ΔΔCt [29, 30]. Los análisis estadísticos de los niveles de expresión se realizaron utilizando una prueba t de Student no apareada de dos colas. Las diferencias significativas se definieron como *P < 0,05, **P < 0,01 y ***P < 0,001.

Recolectamos los mosquitos inyectados con Ant-1174 y los de control antes de una ingesta de sangre a las 72 h PIJ (Fig. 1a) para el ensayo RT-qPCR de la expresión de miR-1174. Tanto nuestros estudios anteriores [7] como el presente experimento mostraron que el nivel de expresión de miR-1174 se redujo significativamente mediante la inyección de Ant-1174 (Fig. 1b). Tres días después del tratamiento, la herida de inyección se había recuperado por completo y no hubo diferencias en los fenotipos de mosquito ormiR-1174 entre el grupo inyectado con Ant-Ct y el grupo de tipo salvaje no inyectado (Fig. 1a, b) [7]. Se recolectaron tres réplicas biológicas de mosquitos inyectados con Ant-1174 y de control Ant-Ct para el análisis proteómico. Se detectaron un total de 5892 proteínas en estas seis muestras, de las cuales 5875 proteínas quedaron después del filtrado y la normalización de los datos. Utilizando el análisis diferencial de expresión de proteínas con los criterios de valor de P <0,05 y cambio de veces <0,83 o > 1,2, como se utiliza en otros estudios [13,14,15,16], determinamos 383 DEP, de las cuales 258 estaban reguladas positivamente y 125 se regularon a la baja (Fig. 1c; archivo adicional 8: Tabla S8). El análisis de conglomerados jerárquico mostró que estos 383 DEP se separaron en clados regulados hacia arriba y hacia abajo, y que el grupo Ant-1174 se diferenciaba del grupo de control (Fig. 1d); por tanto, el agotamiento de miR-1174 provocó sustancialmente una respuesta global de expresión de proteínas en los mosquitos.

Realizamos un análisis de enriquecimiento funcional de estos 383 DEP mediante GO y encontramos que 137, 166 y 88 DEP estaban enriquecidos en procesos biológicos, componentes celulares y función molecular, respectivamente (Fig. 1e). El análisis funcional de las DEP mostró que la vía de la actividad catalítica fue el proceso biológico más enriquecido entre las DEP, seguida por la vía de la actividad hidrolasa. También se enriquecieron las vías relacionadas con la serina, la actividad de la serina hidrolasa, la actividad de la peptidasa de tipo serina y la actividad de la endopeptidasa de tipo serina. El análisis funcional también sugirió que el agotamiento de miR-1174 afectaba el metabolismo de los aminoácidos y la respuesta catalítica de otras enzimas. El análisis de enriquecimiento de la vía KEGG mostró que cinco proteínas se enriquecieron en la vía de los lisosomas (aag04142), dos proteínas se enriquecieron en la vía de elongación de ácidos grasos (aag00062) y dos proteínas se enriquecieron en la vía del metabolismo del almidón y la sacarosa (aag00500) (Fig. 1f ). En la vía del lisosoma enriquecido, cuatro proteínas estaban reguladas positivamente (AAEL010765, AAEL012341, AAEL006854 y AAEL004120) y una estaba regulada negativamente (AAEL006390) (Fig. 1f). En resumen, los resultados del análisis de enriquecimiento de GO y del análisis de enriquecimiento de la vía KEGG sugirieron que miR-1174 desempeña funciones reguladoras importantes en las vías del metabolismo de los aminoácidos, el metabolismo de los nucleótidos, el metabolismo de los ácidos grasos y el metabolismo del azúcar.

Detección de proteínas expresadas diferencialmente después del agotamiento de miR-1174. a Mosquitos inyectados con Ant-1174 y controles a las 72 h PIJ. b Niveles de miR-1174 en los mosquitos y controles inyectados con Ant-1174. Los datos se muestran como la media ± SEM de 3 experimentos independientes. c Gráfico del volcán (cambio de veces> 1,2 o <0,83, P <0,05) que ilustra las proteínas expresadas diferencialmente entre los grupos Ant-1174 y control. Las proteínas expresadas diferencialmente con regulación positiva significativa se muestran en rojo, las proteínas expresadas diferencialmente con regulación negativa significativa se muestran en azul y las proteínas sin diferencias significativas se muestran en gris. d Análisis de agrupamiento jerárquico de las proteínas expresadas diferencialmente visualizadas como un mapa de calor. Los bloques de colores en diferentes posiciones representan la expresión relativa de las proteínas correspondientes: el rojo representa la expresión alta y el azul representa la expresión baja. e Gráfico de burbujas que muestra el enriquecimiento GO de Ant-1174 frente a Control. f Vías KEGG enriquecidas por proteínas expresadas diferencialmente entre Ant-1174 y el grupo de control. Ant-1174/Ant-Ct, oligonucleótidos antisentido (antagomirs) Ant-1174/Ant-Ct; BP, Proceso biológico; CC, componente celular; GO, ontología genética; KEGG, Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto; MF, función molecular; miARN-1174, microARN-1174; PIJ, postinyección; Peso, tipo salvaje

A continuación, realizamos un análisis metabolómico no dirigido de los grupos Ant-1174 y de control para dilucidar los metabolitos diferenciales que resultaron del agotamiento de miR-1174 en Ae. mosquitos aegypti. Todas las muestras en el gráfico de puntuación PCA estaban dentro del IC del 95% (Fig. 2a), lo que confirma que el modelo PCA para nuestros datos era estadísticamente confiable. De manera similar, según el diagrama OPLS-DA, todas las muestras estaban dentro del IC del 95% con R2Y = 0,988 y Q2 = 0,931 (Fig. 2b), lo que confirma que el modelo OPLS-DA para identificar los metabolitos diferenciales era confiable. Además, en el diagrama de prueba de reemplazo, los valores R2Y y Q2 del modelo OPLS-DA original fueron mayores que los valores R2Y y Q2 del diagrama de prueba de reemplazo, y la intersección de la línea de regresión Q2 y el eje vertical fue menor que cero. (Figura 2c). Estas observaciones indican que el modelo OPLS-DA establecido no estaba sobreajustado y tenía buena previsibilidad.

Perfil metabolómico de mosquitos empobrecidos en miR-1174. a Gráfico de dispersión de puntuación del modelo PCA para grupos con control de calidad. Todas las muestras estaban dentro del intervalo de confianza del 95% (elipse T cuadrada de Hotelling). b Gráfico de dispersión de puntuación del modelo OPLS-DA para Ant-1174 frente a Control. c Prueba de permutación del modelo OPLS-DA entre Ant-1174 y los grupos de control. Intersecciones: R2Y(cum) = (0, 0,79), Q2(cum) = (0, − 0,97). d Gráfico volcánico de metabolitos diferenciales. Los puntos rojos representan metabolitos regulados positivamente, los puntos azules son los regulados negativamente. El eje X indica el cambio de log2 y el eje Y mide el valor P − log10. e Mapa de calor de metabolitos diferenciales. Los metabolitos regulados negativamente están resaltados en azul y agrupados en la parte superior izquierda, los metabolitos regulados positivamente están representados en rojo y agrupados en la parte inferior izquierda. f Clasificación de metabolitos regulados positivamente y metabolitos regulados negativamente. g Vías de KEGG enriquecidas por los metabolitos diferenciales. El tamaño del círculo es directamente proporcional al número de metabolitos diferenciales; la profundidad del rojo es inversamente proporcional al valor P. h Análisis de vías metabólicas de metabolitos diferenciales. En el diagrama de burbujas, cada burbuja representa una vía metabólica y el tamaño de la burbuja representa el tamaño del factor de influencia de la vía en el análisis topológico. Ant-1174, oligonucleótido antisentido (antagomirs) Ant-1174; KEGG, Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto; miR-1174, microARN-1174; OPLS-DA, proyecciones ortogonales a estructuras latentes-análisis discriminante; PCA, análisis de componentes principales

La detección diferencial mediante VIP (en un modelo OPLS-DA)> 1 y el valor de P (en una prueba t de Student) <0,05 produjo 292 metabolitos diferenciales, de los cuales 141 estaban regulados positivamente y 151 estaban regulados negativamente (Fig. 2d; archivo adicional 9: Cuadro S9). El análisis de agrupamiento jerárquico de estos metabolitos diferenciales mostró que las muestras del mismo grupo se agruparon en un clado y las de diferentes grupos se separaron entre sí (Fig. 2e; archivo adicional 10: Tabla S10). Los metabolitos regulados positivamente podrían dividirse en 10 superclases, de las cuales las cinco principales eran ácidos orgánicos y sus derivados; lípidos y moléculas similares a lípidos; compuestos organoheterocíclicos; compuestos orgánicos de oxígeno; y bencenoides (Fig. 2f; archivo adicional 11: Tabla S11). Los metabolitos regulados negativamente podrían dividirse en 11 superclases, de las cuales las cinco principales eran compuestos orgánicos de oxígeno; ácidos orgánicos y derivados; lípidos y moléculas similares a lípidos; compuestos organoheterocíclicos; y nucleósidos, nucleótidos y análogos (Fig. 2f; archivo adicional 11: Tabla S11). En la superclase de ácidos orgánicos y derivados, 41 metabolitos (76%) del modo POS y 24 metabolitos (69%) del modo NEG pertenecían a la subclase de aminoácidos, péptidos y análogos. En la superclase de compuestos orgánicos de oxígeno, ocho metabolitos (62%) del modo POS y 29 metabolitos (81%) del modo NEG pertenecían a la subclase carbohidratos y conjugados de carbohidratos. Luego realizamos un análisis de enriquecimiento de la vía KEGG de estos DEM (Fig. 2g; archivo adicional 12: Tabla S12), que reveló que los DEM se enriquecieron principalmente en la vía de biosíntesis de aminoacil-ARNt, seguido del metabolismo de las purinas, el metabolismo de los glicerofosfolípidos y el metabolismo de la galactosa. , metabolismo de pirimidina, metabolismo de glicina, serina y treonina, metabolismo de arginina y prolina, interconversiones de pentosas y glucuronato, metabolismo de alanina, aspartato y glutamato, metabolismo de cisteína y metionina, degradación de lisina, metabolismo de aminoazúcares y nucleótidos de azúcar, metabolismo de esfingolípidos y metabolismo de glioxilato y dicarboxilato .

En la vía del metabolismo de las purinas, los ribonucleótidos de urato e hipoxantina estaban regulados positivamente, y el glioxilato, la d-ribosa 5-fosfato, el nucleósido de adenina difosfato, la adenosina 3′,5′-difosfato, la adenosina, la aminimidazol riosse y el 3′-adenosina fosfato estaban regulados negativamente. Los ribonucleótidos de uracilo, los ribonucleótidos de citosina y la citidina en la vía del metabolismo de la pirimidina también estaban regulados negativamente. En la vía del metabolismo de la glicina, la serina y la treonina, la l-treonina y la aminoacetona estaban reguladas al alza, mientras que la fosfato-l-serina, la fosfato-l-hiperserina y la l-serina estaban reguladas a la baja. La serina es un precursor importante para la síntesis de purinas, pirimidinas y fosfolípidos, y la regulación negativa de la serina y sus derivados podría afectar la replicación del ADN. Un análisis más detallado mostró que las vías más estrechamente relacionadas con la regulación negativa de miR-1174 eran la vía de biosíntesis de fenilalanina, tirosina y triptófano y la vía del metabolismo de fenilalanina. En estas vías, la l-fenilalanina y el fenilacetaldehído estaban reguladas positivamente, y la l-tirosina y la d-eritrosa 4-fosfato estaban reguladas negativamente (Fig. 2h).

La regulación negativa de miR-1174 también cambió la acumulación de compuestos en las vías del metabolismo de las purinas (aag00230) y del metabolismo de las pirimidinas (aag00240). En la vía del metabolismo de las purinas, la d-ribosa 5-fosfato, el ADP, la adenosina, la adenosina 3',5'-difosfato, el aminoimidazol ribonucleótido y el 3'-AMP estaban regulados negativamente. En la vía de la pirimidina, el ácido 4,5-dihidroorótico estaba regulado positivamente y el 5'-monofosfato de uridina, el monofosfato de citidina, la citidina y la beta-alanina estaban regulados negativamente. Por lo tanto, especulamos que los fenotipos anormales observados en mosquitos empobrecidos en miR-1174 podrían ser causados ​​por un trastorno generalizado que involucra tanto aminoácidos como nucleótidos.

Dado que muchos DEP y DEM estaban enriquecidos en las vías del metabolismo de los aminoácidos, el metabolismo de las purinas y las pirimidinas, nos centramos en estas tres vías para el análisis integrativo de los DEP y los DEM (Fig. 3). Es de destacar que en la vía del metabolismo de las purinas (aag00230), las proteínas asociadas purina nucleósido fosforilasa (PNP, aag5574096) y GTP:AMP fosfotransferasa AK3 (PAK3, aag5564849) estaban reguladas positivamente, junto con los metabolitos regulados positivamente asociados ácido inosínico o monofosfato de inosina (IMP). , cpdC00130) y ácido úrico o urato (cpdC00366), mientras que los metabolitos regulados negativamente asociados fueron ADP (cpdC00008), glioxilato (cpdC00048), adenosina 3',5'-bisfosfato (cpdC00054), d-ribosa 5-fosfato (cpdC00117), adenosina (cpdC00212), 3'-AMP (cpdC01367) y aminoimidazol ribotida (AIR, cpdC03373). En la vía del metabolismo de la pirimidina (aag00240), la proteína regulada positivamente asociada era PNP (aag5574096), y el metabolito regulado positivamente asociado era ácido 4,5-dihidroorótico o (S)-dihidroorotato (cpdC00337). En la vía del metabolismo de la glicina, serina y treonina (aag00260), las proteínas asociadas glicina N-metiltransferasa (GNMT, aag5576784) y sarcosina deshidrogenasa (AARDH, aag5565677) estaban reguladas positivamente, y los metabolitos asociados l-treonina (cpdC00188), betaína (cpdC00719) ) y aminoacetona (cpd C01888) estaban regulados positivamente, mientras que los metabolitos asociados ácido glioxílico o glioxilato (cpdC00048), l-serina (cpdC00065), 2-oxobutanoato (cpd C00109), d-glicerato (cpd C00258), O-fosfo-l -serina (cpdC01005) y O-fosfo-l-homoserina (cpdC01102) estaban reguladas negativamente. Juntos, estos DEP y DEM asociados tienen funciones importantes en el metabolismo de los aminoácidos y el metabolismo del ADN. Por lo tanto, es posible que el agotamiento de miR-1174 pueda ejercer un amplio impacto en las vías metabólicas de los aminoácidos y nucleótidos en los mosquitos, afectando en consecuencia la succión de sangre, la digestión de la sangre y el desarrollo de los ovarios.

Genes diana de miR-1174. a Sitio de unión previsto dentro de la 3'-UTR del inhibidor de serina proteasa 27A (SPI27A, AAEL014079). b Ensayo indicador de luciferasa dual del sitio de unión dentro de la 3'-UTR del ARNm de SPI27A. c Sitio de unión previsto dentro de la 3′-UTR del ARNm de MCT12. d Ensayo indicador de luciferasa dual del sitio de unión dentro de la 3'UTR del ARNm de MCT12. e Sitio de unión previsto dentro de la 3'-UTR de no característico (UC, AAEL015019). f Ensayo indicador de luciferasa dual del sitio de unión dentro de la 3'UTR del ARNm de UC. g Ensayo de indicador de luciferasa dual para comprobar si miR-1174 se dirige a la 5'-UTR del ARNm de PNP. h Ensayo de indicador de luciferasa dual para comprobar si miR-1174 se dirige al CDS del ARNm de PNP. i Ensayo indicador de luciferasa dual para comprobar si miR-1174 se dirige a la 3'UTR del ARNm de PNP. Las barras de error representan ± SEM de tres experimentos independientes. Los asteriscos indican significación estadística en *P < 0,05 y **P < 0,01; ns, no significativo. CDS, secuencia codificante; miR-1174, microARN-1174; UTR, región no traducida; ARNm, ARN mensajero; PNP, purina nucleósido fosforilasa; SEM: error estándar de la media; 3′-UTR, región 3′ no traducida

Los objetivos candidatos predichos mediante el uso de cuatro programas (ver Métodos) se cruzaron con todas las proteínas reguladas positivamente en los mosquitos empobrecidos en miR-1174, produciendo tres objetivos candidatos: inhibidor de serina proteasa 27A (SPI27A, AAEL014079), transportador de monocarboxilato 12 (MCT12, AAEL002412) y poco característico (UC, AAEL015019). Las secuencias 3'-UTR de SPI27A, MCT12 y UC se obtuvieron mediante 3'-RACE y cada una se clonó en el vector psiCHECKTM-2. Se cotransfectaron células HEK-293T con el plásmido recombinante y un imitador de miR-1174. La actividad luciferasa de luciérnaga (Fluc) y la actividad luciferasa de renilla (Rluc) se detectaron 48 h después de la transfección. Los resultados del ensayo del gen indicador de luciferasa dual mostraron que la relación Rluc/Fluc fue significativamente menor que la del grupo de control, lo que muestra que SPI27A, MCT12 y UC eran genes objetivo de miR-1174 (Fig. 3a-f). Además, mutamos los sitios objetivo predichos de miR-1174 dentro de sus 3'-UTR, y los resultados del ensayo del gen indicador de luciferasa dual mostraron que la actividad de la luciferasa se recuperó después de la mutación del sitio, lo que indicó que el sitio mutante era el objetivo de miR-1174. (Figuras 3a a f). Estos tres objetivos fueron derribados mediante inyección de ARN bicatenario (dsRNA), pero no se observaron fenotipos anormales en los mosquitos (datos no mostrados). Es necesario confirmar aún más si estos tres genes diana tienen funciones importantes en los mosquitos mediante la eliminación o sobreexpresión de genes.

El análisis integrador de los DEP y DEM mostró que la PNP (AAEL002269) estaba asociada con las vías del metabolismo de las purinas, el metabolismo de las pirimidinas y el metabolismo de la niacina-nicotinamida (Fig. 4), lo que indica que la PNP podría desempeñar funciones importantes en los mosquitos. Por lo tanto, investigamos los patrones de expresión espaciotemporal del gen PNP mediante RT-qPCR y ensayos de transferencia Western. Se recolectaron mosquitos hembras adultas en 14 puntos temporales para ensayos de RT-qPCR; Los resultados mostraron que la expresión de PNP aumentó rápidamente después de que los mosquitos ingirieron sangre, con el nivel de expresión más alto a las 6 h PBM y el nivel de expresión más bajo a las 48 h PBM (Fig. 5a). El nivel de proteína de PNP se elevó considerablemente, alcanzando una meseta de 12 a 24 h PBM y luego disminuyó a un mínimo a las 48 h PBM; esta tendencia se retrasó algo en comparación con el nivel de ARNm (Fig. 5b). Para determinar la expresión espacial de PNP, recolectamos diferentes tejidos a las 72 h PE y 6 h PBM para RT-qPCR y ensayos de transferencia Western. Los resultados mostraron que PNP se expresaba en niveles altos en la grasa corporal y la cabeza y mostraba niveles de expresión bajos en el intestino medio y el ovario (Fig. 5c, d). La PNP se indujo significativamente en respuesta al agotamiento de miR-1174 (Fig. 5e), lo que implica que miR-1174 podría regular negativamente la PNP. Luego predijimos la interacción de unión entre miR-1174 y PNP, pero no encontramos sitios objetivo dentro de 5'-UTR, CDS o 3'-UTR del ARNm de PNP, un resultado que fue confirmado aún más por los resultados del ensayo del gen indicador de luciferasa dual. (Figura 3g-i).

Análisis integrado de proteínas y metabolitos expresados ​​diferencialmente. El rojo indica regulación positiva y el azul indica regulación negativa. La línea de puntos indica reacciones de varios pasos y la línea continua indica reacciones de un solo paso. La flecha de dos direcciones representa la equivalencia entre diferentes escenarios, mientras que la flecha de una dirección significa transformación unidireccional entre sustrato y producto o de un metabolito a otro. AIR, ribótida de aminoimidazol; IMP, monofosfato de inosina; PAK3, GTP:AMP fosfotransferasa; PNP, purina nucleósido fosforilasa; GNMT, glicina N-metiltransferasa; SARDH, sarcosina deshidrogenasa

Expresión de PNP. una expresión temporal de PNP basada en RT-qPCR en mosquitos hembra adultos. b Análisis de transferencia Western de PNP en mosquitos adultos. Para comparar con los niveles de ARNm en a, las señales de los resultados de la transferencia Western (a continuación) se convirtieron en números utilizando el software Image J para cuantificar la expresión de proteínas (arriba). c Expresión espacial basada en RT-qPCR a las 72 h PE. d Expresión espacial basada en RT-qPCR a las 6 h PBM. e Expresión de PNP en respuesta al agotamiento de miR-1174. Las hembras fueron disecadas en solución salina tamponada con fosfato para la recolección de tejido y los bolos de sangre se extrajeron del intestino medio. Se utilizó RPS7 como control para RT-qPCR y tubulina como control para la transferencia Western. Todos los gráficos se presentan como media ± SEM de 3 experimentos independientes. Las diferencias en P <0,05 fueron estadísticamente significativas y las diferencias en P <0,01 se consideraron altamente significativas desde el punto de vista estadístico. FB, Cuerpo graso; HD, cabeza; LO, sobrante; Mg: intestino medio; miR-1174, microARN-1174; PBM, después de la ingesta de sangre; PE, post-cierre; PNP, purina nucleósido fosforilasa; RT-qPCR, PCR cuantitativa en tiempo real; SEM, error estándar de la media

Para revelar la función de PNP en Ae. Aegypti, inyectamos el ARNbc de PNP aproximadamente a las 12-20 h PE y confirmamos su regulación negativa mediante RT-qPCR y ensayos de transferencia Western (Fig. 6a-d). El silenciamiento de PNP no afectó la absorción de azúcar ni la ingesta de sangre, y no se observaron alteraciones evidentes en la morfología a las 6 h de PBM en hembras inyectadas con dsPNP en comparación con las muestras de control. Sin embargo, surgieron fenotipos anormales en la digestión de la sangre y el crecimiento de los ovarios a partir de las 12 h de PBM en estas hembras inyectadas con dsPNP (Fig. 6e). Más específicamente, los mosquitos inyectados con dsPNP mostraron una digestión de sangre más lenta y ovarios más pequeños en comparación con las hembras inyectadas con dsEGFP y los controles de tipo salvaje. Las diferencias en el color de la sangre y el tamaño de los ovarios fueron más obvias a las 24 h PBM. Cuando los mosquitos fueron disecados a las 48 y 72 h PBM, en los mosquitos de los dos grupos de control, casi no quedaba sangre en el intestino medio y los ovarios mostraron un desarrollo normal; en comparación, en los mosquitos del grupo dsPNP, al menos la mitad de la sangre ingerida no estaba digerida y el desarrollo de los ovarios estaba estancado. En particular, los mosquitos empobrecidos en PNP comenzaron a morir a las 15 h PBM, la mitad de ellos habían muerto dentro de las 48 h PBM y casi todos habían muerto dentro de las 72 h PBM (Fig. 6f). Finalmente, se observó una reducción promedio de la oviposición de 100 veces en las hembras inyectadas con dsPNP en comparación con los huevos recolectados de hembras inyectadas con WT y dsEGFP (Fig. 6g, h).

Fenotipos anormales causados ​​por la caída de PNP. Resultados de RT-qPCR que muestran la caída de PNP a las 72 h PE. b Resultados de RT-qPCR que muestran la caída de PNP a las 6 h de PMB. c Resultados de la transferencia Western que muestran la caída de PNP a las 72 h PE. d Resultados de transferencia Western que muestran la caída de PNP a las 6 h PBM. e Fenotipos causados ​​por la interferencia del ARN de PNP. f Estadísticas de puesta de huevos (N = 10 hembras × 6 réplicas biológicas). g Estadísticas de la tasa de succión de sangre (N = 40 hembras × 4 réplicas biológicas). h. Estadísticas de tasa de supervivencia a las 72 h PBM (N = 60 hembras por grupo × 3 réplicas). Se utilizó RPS7 como control para RT-qPCR y dsEGFP como control para la interferencia de ARN. Las barras de error representan ± SEM de tres experimentos independientes. Las diferencias en P < 0,05 se consideraron estadísticamente significativas y las diferencias en P < 0,01 se consideraron altamente significativas desde el punto de vista estadístico. dsEGFP, ARN bicatenario de proteína fluorescente verde mejorada; dsPNP, ARN bicatenario de purina nucleósido fosforilasa; PBM, después de la ingesta de sangre; PE, post-cierre; RT-qPCR, PCR cuantitativa en tiempo real; RPS7, proteína ribosómica S7; SEM: error estándar de la media; Peso, tipo salvaje

Después de la regulación negativa de PNP, la digestión de la sangre de los mosquitos y el desarrollo de los ovarios quedaron seriamente inhibidos. Para comprender el mecanismo molecular potencial de la PNP en estos procesos fisiológicos, investigamos el nivel de transcripción de varios genes que se sabe que actúan en las vías de señalización implicadas en el desarrollo de los ovocitos (Fig. 7). El desarrollo de los ovarios depende de la síntesis de la proteína vitelogenina (Vg) en el cuerpo graso [31]. Encontramos que el nivel de expresión de Vg se redujo significativamente a las 24 h de PBM en los mosquitos empobrecidos en PNP (Fig. 7a). La síntesis de Vg se asocia principalmente con la señalización de la hormona juvenil, la ecdisona, el péptido similar a la insulina y la señalización de nutrientes de aminoácidos [32,33,34,35]. El PNP se expresa altamente en los mosquitos alimentados con sangre y, por lo tanto, el PNP podría funcionar en los mosquitos después de la absorción de la sangre; en comparación, la vía de señalización de la hormona juvenil generalmente afecta el desarrollo del ovario antes de la absorción de sangre. El examen de los niveles de transcripción de algunos genes clave en la señalización de ecdisona, la señalización de péptidos similares a la insulina y la señalización de nutrientes de aminoácidos a las 24 h PBM reveló que EcR y E75A estaban regulados positivamente y E74B estaba regulado negativamente (Fig. 7b-d), el tipo de insulina Los genes de la vía peptídica MIR (receptor de insulina de mosquito) y PI3K (fosfatidilinositol 3-quinasa) estaban regulados positivamente (Fig. 7e, f), pero ILP3 (péptido similar a la insulina 3) y FoxO (caja O de horquilla) no cambiaron (datos no mostrados) . TOR (objetivo de la rapamicina), un gen clave de la vía de señalización de nutrientes de aminoácidos, no mostró cambios significativos en el nivel de expresión (Fig. 7g). Genes importantes en la vía apoptótica, a saber, Dronc y caspasa8, estaban significativamente regulados positivamente (Fig. 7h, i), lo que indica que la vía apoptótica puede activarse. De hecho, una gran cantidad de células mostraron muerte programada, lo que resultó en una muerte masiva de mosquitos hembra a las 36 h PBM.

La eliminación de PNP en mosquitos cambia la expresión de algunos genes de la vía de señalización y afecta el metabolismo energético. Se muestran expresiones de lo siguiente. un gen de vitelogenina (Vg). b Gen del receptor de ecdisteroides (EcR). c Gen de la proteína 75A inducida por ecdisona (E75A). d Gen de la proteína 74B inducida por ecdisona (E74B). e Gen del receptor de insulina del mosquito (MIR). f Gen de la fosfoinositida 3-quinasa (PI3K). g Diana del gen de la rapamicina (TOR). h Gen caspasa regulador de la muerte similar a Nedd2 (Dronc). i Gen 8 relacionado con la autofagia (ATG8). j Nivel de ATP a las 36 h PBM. k Nivel de TG a las 72 h PE sin ingesta de sangre. l Nivel de TG a las 36 h PBM. Los datos se presentan como la media ± SEM de 3 experimentos independientes. Las comparaciones estadísticas entre grupos se realizaron mediante un ANOVA unidireccional seguido de una prueba t de Student no apareada. Las diferencias en P < 0,05 se consideraron estadísticamente significativas y las diferencias en P < 0,01 se consideraron altamente significativas desde el punto de vista estadístico. ANOVA, Análisis de varianza; dsEGFP, ARN bicatenario de proteína fluorescente verde mejorada; dsPNP, ARN bicatenario de purina nucleósido fosforilasa; RPS7, proteína ribosómica S7; TG, triglicéridos; Peso salvaje tipo

Los mosquitos empobrecidos en PNP comenzaron a perder la capacidad de volar a las 15 h PBM y finalmente murieron dentro de las 72 h PBM. La PNP es una enzima clave conservada implicada en la vía de degradación y recuperación de purinas, que puede ayudar a sintetizar ATP. Nuestra hipótesis es que la regulación negativa de la PNP también podría afectar el metabolismo de la materia y la energía en los cuerpos grasos. Como se esperaba, el contenido de ATP de los mosquitos hembras empobrecidos en PNP fue mucho menor que el de los mosquitos WT (Fig. 7j). Los lípidos se almacenan en el cuerpo adiposo y el uso de lípidos para el metabolismo básico requiere una movilización continua de triglicéridos (TG) desde el cuerpo adiposo a otros tejidos. Los cuerpos grasos de los grupos inyectados con dsPNP y dsGEFP se recolectaron tanto a las 72 h PE como a las 36 h PBM para determinar el contenido de TG. Los resultados mostraron que no se había producido ningún cambio significativo en el contenido de TG antes de la alimentación con sangre (Fig. 7k), pero que el contenido de TG disminuyó significativamente en los mosquitos dsPNP a las 36 h PBM (Fig. 7l). Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que la regulación negativa de PNP podría alterar la utilización de nutrientes y la transformación de energía en los mosquitos, bloquear la vía de señalización nutricional en el cuerpo graso y obstaculizar el desarrollo ovárico.

Nuestros estudios anteriores demostraron que cuando se silencia el miR-1174 específico para mosquitos y el intestino medio, los mosquitos no pueden absorber el azúcar y la sangre con normalidad, el desarrollo de los ovarios se atrofia y, como resultado, se reduce la tasa de reproducción del mosquito; Todos estos fenotipos anormales pueden restaurarse parcialmente mediante la eliminación del ARNi de su gen objetivo SHMT [7]. Sin embargo, la caída de SHMT no inhibe la absorción tanto de azúcar como de sangre; solo inhibe la digestión, absorción y utilización de la sangre, afectando así el desarrollo de los ovarios y reduciendo la tasa de oviposición [8]. Dado que SHMT está regulado negativamente por miR-1174, lógicamente, si miR-1174 solo se dirigiera a SHMT, los fenotipos anormales causados ​​por el agotamiento de miR-1174 deberían ser consistentes con los fenotipos anormales observados después de la sobreexpresión de SHMT, mientras que los fenotipos anormales después de SHMT RNAi deberían ser consistente con los fenotipos causados ​​por la sobreexpresión de miR-1174. Sin embargo, hasta ahora no está claro si SHMT es el único gen diana de miR-1174 en los mosquitos. Descubrimos que miR-1174 solo se expresaba altamente en el intestino medio de los mosquitos y que no se expresaba o solo mostraba trazas de expresión en otros tejidos. Por el contrario, no hubo o solo hubo rastros de expresión de SHMT en el intestino medio, pero se expresó altamente en el cuerpo graso fuera del intestino medio. Dado que miR-1174 y SHMT se expresan específicamente en tejidos diferentes, pueden existir otros modos de interacción o vías de señalización entre ellos. Por lo tanto, en este estudio, en un momento en el que los mosquitos adultos han madurado completamente y se han recuperado completamente de la herida de la inyección, recolectamos mosquitos inyectados con Ant-1174 y controles para la detección proteómica y metabolómica, con la expectativa de realizar pruebas de detección de DEP y DEM. . Para revelar aún más el mecanismo molecular de este miARN como molécula reguladora clave en los mosquitos chupadores de sangre, analizamos funcionalmente las vías de señalización asociadas con estos DEP y DEM.

Tanto el análisis de enriquecimiento de GO como el análisis de enriquecimiento de la vía KEGG proporcionaron evidencia de que miR-1174 actúa principalmente en las vías metabólicas de aminoácidos, nucleótidos, ácidos grasos y azúcar. Cabe señalar que, aunque estos DEP se detectaron después del silenciamiento de miR-1174, su expresión diferencial no está necesariamente causada directamente por el agotamiento de miR-1174. Generalmente, solo los genes diana están regulados directamente por este miARN, mientras que es mucho más probable que la expresión diferencial de aquellos genes no diana esté regulada indirectamente por este miARN. En este contexto, entre las proteínas reguladas positivamente, solo se confirmó que SPI27A (AAEL014079), MCT12 (AAEL002412) y UC (AAEL015019) eran los genes objetivo de miR-1174 (Fig. 3). La eliminación del ARNi de estos tres genes diana no provocó ningún fenotipo anormal en los mosquitos experimentales. Una posible explicación para este resultado es que la eliminación del ARNi no fue suficiente para impedir por completo la expresión de las proteínas correspondientes, que probablemente todavía estén funcionando en los mosquitos. Por lo tanto, es cierto que podrían ser necesarias pruebas más sólidas mediante la eliminación y la sobreexpresión para determinar las funciones biológicas de estos genes diana en los mosquitos.

Para revelar las funciones biológicas de otros genes más sensibles a miR-1174, los eliminamos uno por uno utilizando tecnología de ARNi y descubrimos que solo se observaron fenotipos anormales en mosquitos sin PNP después de alimentarse de sangre. El agotamiento de PNP no afectó la ingesta normal de sangre, pero se bloqueó la digestión de la sangre y el desarrollo de los ovarios, y se acortó la vida útil de los mosquitos. El PNP se expresaba altamente en el cuerpo graso, por lo que asumimos que su regulación negativa afectaría directamente el metabolismo de los nutrientes en el cuerpo graso. La proteína vitelogenina (Vg) se sintetiza en el cuerpo graso y está relacionada con la señalización de la hormona juvenil, la señalización de la ecdisona, la señalización del péptido similar a la insulina y la señalización de los nutrientes de los aminoácidos [35,36,37]. Los resultados de RT-qPCR mostraron que el agotamiento de PNP condujo a una regulación negativa significativa de Vg y que la vía de señalización de ecdisona y la vía de señalización de péptidos similares a la insulina relacionadas con el desarrollo ovárico también se vieron afectadas. Sin embargo, aún se desconoce si la PNP regula la síntesis y expresión de vitelogenina a través de estas señales de las vías hormonales y cómo lo hace.

La PNP actúa en las vías del metabolismo de las purinas, las pirimidinas y la niacina-nicotinamida; en particular, la vía del metabolismo niacina-nicotinamida puede producir NADH. Una mayor fosforilación oxidativa de NADH puede producir una gran cantidad de ATP para mantener las actividades vitales [38, 39]. La expresión de la proteína PNP aumentó significativamente después de la regulación negativa de miR-1174, lo que sugiere que miR-1174 puede apuntar directa o indirectamente a PNP. Sin embargo, tanto los resultados previstos como los resultados de los ensayos indicadores de luciferasa dual indicaron que PNP no era un gen diana directo de miR-1174. Por lo tanto, es muy probable que miR-1174 regule la PNP indirectamente a través de otros genes u otras vías de señalización. El trastorno en el metabolismo de la glicina, la serina y la treonina afecta el metabolismo de las purinas y reduce el AMP y el ADP, lo que conducirá a una disminución del ATP [40]. Descubrimos que el agotamiento de miR-1174 afectó las vías metabólicas de glicina, serina y treonina, así como las vías metabólicas de purinas y pirimidinas, lo que sugiere que miR-1174 regula la digestión de la sangre y el desarrollo de los ovarios de Ae. aegypti participando en el metabolismo energético y de nucleótidos.

La PNP fosforila reversiblemente los nucleósidos de purina en bases de purina y ribosa-1-fosfato en las vías de recuperación de las purinas, y la deficiencia de PNP conduce a la acumulación de nucleósidos de purina [41]. En los mamíferos, la ausencia de PNP conduce a un aumento significativo en la afinidad de la desoxicitidina quinasa (dCK) por la desoxicitidina, lo que significa que se sintetizará una cantidad significativa de trifosfato de desoxicitidina (dGTP), y un exceso de dGTP romperá el equilibrio de los desoxirribonucleótidos, afectará la síntesis de ADN. e inducir la apoptosis de las células T [42]. La deficiencia de PNP provoca acumulación de adenosina y apoptosis de las células tumorales [43]. Se detectaron genes clave en la vía apoptótica después de la eliminación de PNP, y tanto los genes Dronc como caspasa8 estaban significativamente regulados positivamente. caspasa8 es un gen importante para iniciar la apoptosis y su activación puede activar otros genes de caspasa conocidos [44]. Los mosquitos empobrecidos en PNP mostraron una regulación negativa significativa del contenido de ATP y TG in vivo. Estos mosquitos murieron dentro de las 48 h posteriores a la inhalación de sangre, posiblemente debido a la falta de ATP y TG que activan la vía apoptótica, lo que lleva a una muerte programada anormal de una gran cantidad de células.

La PNP se expresa ligeramente o incluso no se expresa en absoluto en el intestino medio y el ovario, y se expresa mucho en la cabeza, la grasa corporal y otros tejidos residuales. Sin embargo, cuando fue derribado, la función del intestino medio y el desarrollo de los ovarios se vieron gravemente afectados. El silenciamiento de la PNP podría ejercer primero un efecto sobre el cuerpo graso y luego las señales de respuesta se transmitirían al intestino medio. Esto luego afectaría la expresión de las enzimas digestivas, lo que provocaría disfunciones en la digestión de la sangre y en la absorción y utilización de nutrientes, de modo que no hay suficientes nutrientes para sintetizar los precursores de vitelogenina, lo que en última instancia resultaría en un desarrollo anormal de los ovarios. Aunque el PNP se reguló significativamente en los mosquitos empobrecidos en miR-1174, no encontramos ningún sitio de unión de miR-1174 dentro de su 5'-UTR, CDS o 3'UTR. Esto implica que la PNP está regulada indirectamente por miR-1174, que podría regular actividades vitales importantes como la absorción de azúcar, la ingestión y digestión de sangre, el desarrollo de los ovarios e incluso la duración de la vida mediante la regulación sinérgica de múltiples vías de señalización mediante múltiples genes diana. Aunque hemos identificado DEP en este estudio, aún se necesitan más estudios para determinar cuáles de estos DEP están regulados directamente por miR-1174 y cuáles están regulados indirectamente, y cuáles de estos genes son responsables de diferentes tipos de fenotipos anormales en diferentes niveles de respuesta. después de la regulación negativa de miR-1174.

Este estudio investigó el mecanismo molecular del miR-1174 específico para mosquitos y intestino medio en mosquitos Ae.aegypti. Mediante el uso de técnicas de proteómica y metabolómica, identificamos los DEP y DEM en mosquitos empobrecidos en miR-11174. Su análisis funcional mostró que el agotamiento de miR-1174 afectaba las vías del metabolismo de aminoácidos, nucleótidos, ácidos grasos y glucosa. Se realizó una eliminación de ARNi para estudiar más a fondo las funciones de algunos DEP. Específicamente, nos dirigimos a la purina nucleósido fosforilasa (PNP, AAEL002269), un gen regulado positivamente al que no está dirigido directamente miR-1174, pero que tiene funciones importantes en los mosquitos. Cuando se regulaba negativamente la PNP, se inhibía la digestión de la sangre, se obstaculizaba el desarrollo de los ovarios y se acortaba la vida útil de los mosquitos. La regulación negativa de la PNP afecta las vías de señalización hormonal, las vías de apoptosis y algunas vías metabólicas de nutrientes, lo que sugiere que la PNP puede regular estas vías de señalización para controlar la digestión de la sangre y el desarrollo de los ovarios. En conjunto, nuestros hallazgos revelaron los cambios moleculares causados ​​por el agotamiento de miR-1174 en los niveles de proteoma y metaboloma, y ​​establecieron las funciones biológicas de algunos DEP. Como tal, proporcionan información valiosa sobre las funciones de un miARN específico de linaje en las vías reguladoras de la digestión sanguínea y la señalización de nutrientes.

Todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el artículo y sus archivos adicionales.

Oligonucleótidos antisentido (antagomirs)

Proteínas expresadas diferencialmente

Metabolitos expresados ​​diferencialmente.

Ontología de genes

Enciclopedia de genes y genomas de Kioto

microARN-1174

MicroARN

Después de la comida de sangre

Posteclosión

Post-inyección

Gen de la purina nucleósido fosforilasa

interferencia de ARN

PCR cuantitativa en tiempo real

Gen de la serina hidroximetiltransferasa

Etiqueta de masa en tándem

Región 3′ no traducida

Amplificación rápida 3' del extremo del ADNc

ARN bicatenario de proteína fluorescente verde mejorada

ARN bicatenario de purina nucleósido fosforilasa

Tipo salvaje

Proteína ribosómica S7

Error estandar de la media

Cuerpo gordo

cabeza

sobrante

intestino medio

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Agradecemos a la empresa BIOTREE (Shanghai, China) por la asistencia técnica. Agradecemos a Marian Goldsmith (Profesora Emérita, Centro de Biotecnología y Ciencias de la Vida de la Universidad de Rhode Island) por su lectura crítica, su amable discusión y sus sugerencias constructivas.

Este trabajo fue apoyado por la Beca de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32172797), el Proyecto del Plan de Ciencia y Tecnología de Chongqing (2022NSCQ-MSX5897), el Proyecto de Innovación en Investigación para Graduados de Chongqing (CYB21132) y el Proyecto de Innovación en Investigación de posgrado de Chongqing (CYS22254).

Yangrui Luo, Dun Liu y Yuanmei Wang contribuyeron igualmente a este trabajo.

Laboratorio Estatal Clave de Insectos de Recursos, Universidad del Suroeste, Beibei, Chongqing, 400716, República Popular de China

Yangrui Luo, Yuanmei Wang, Fan Zhang, Yankun Xu, Qian Pu, Lu Zhao, Tianqi Wei, Ting Fan, Yuqi Lou y Shipping Liu

Facultad de Ciencias de la Vida Marina, Universidad Oceánica de China, Qingdao, 266003, Shandong, República Popular China

Duan Liu

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SL concibió la investigación, diseñó y realizó experimentos y fue uno de los principales contribuyentes a la redacción del manuscrito. YL, DL y YW realizaron experimentos, interpretaron los datos y contribuyeron a la redacción. FZ, YX, QP, LZ, TW, TF y YL criaron mosquitos y contribuyeron a escribir. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Shiping Liu.

Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas aprobadas por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Southwest.

No aplica.

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

. Los datos originales extraídos de 6 muestras experimentales.

. Las 5875 proteínas retenidas después del pretratamiento.

. Proteínas expresadas diferencialmente seleccionadas según los criterios descritos.

. Los 5714 picos retenidos en modo POS después del pretratamiento.

. Los 5609 picos retenidos en modo NEG después del pretratamiento.

. Los 11270 picos retenidos en los modos combinados POS y NEG después del pretratamiento.

. Secuencias de cebadores utilizados en este estudio.

. Todas las proteínas expresadas diferencialmente (DEP) después del cribado diferencial.

. Todos los metabolitos diferenciales (DEM) después del cribado diferencial.

. Matriz de datos para la agrupación jerárquica de DEM.

. Información de clasificación de DEM. El rojo aquí presenta los DEM regulados al alza en cada superclase que se muestra en la figura 2F; el azul representa los DEM regulados a la baja en cada superclase que se muestra en la figura 2F.

. Análisis de enriquecimiento de vías de estos DEM.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado al autor(es) original(es) y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. La exención de dedicación de dominio público de Creative Commons (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) se aplica a los datos disponibles en este artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito a los datos.

Reimpresiones y permisos

Luo, Y., Liu, D., Wang, Y. et al. El análisis combinado del proteoma y el metaboloma proporciona información sobre la función del microARN-1174 en los mosquitos Aedes aegypti. Vectores de parásitos 16, 271 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05859-1

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Recibido: 17 de mayo de 2023

Aceptado: 30 de junio de 2023

Publicado: 09 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05859-1

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