Introducción a la prueba de flujo lateral: fortalezas, limitaciones y aplicaciones

Aug 01, 2023

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Las pruebas de diagnóstico son clave en muchas áreas, incluida la atención médica y la medicina preventiva, la seguridad alimentaria y el monitoreo ambiental. Como tal, los analistas necesitan ensayos apropiados y precisos que se adapten al tipo de muestra, analito y entorno de prueba que respeten las limitaciones monetarias, de tiempo y del operador. Una de esas pruebas para llenar este nicho es la prueba de flujo lateral (LFT). En este artículo, consideraremos qué son las LFT, cómo funcionan y sus aplicaciones.

¿Qué es una prueba de flujo lateral (LFT)?

¿Cuáles son los nombres comunes alternativos para una prueba de flujo lateral?

¿Cómo funciona un inmunoensayo de flujo lateral (LFIA)?

Cómo leer un dispositivo de flujo lateral (LFD)

Consideraciones de diseño de prueba de flujo lateral

- Tipo de prueba de flujo lateral

- Anticuerpos

- Tipo de etiqueta y sistema de detección correspondiente

- Almohadilla de muestra

- Almohadilla conjugada

- Membrana

- Almohadilla absorbente

- Muestra

- Multiplexación

Fortalezas y debilidades de los ensayos de flujo lateral.

Aplicaciones comunes para un ensayo de flujo lateral (LFA) y sus objetivos

- Objetivo de la prueba de embarazo

- Prueba de COVID en casa objetivo

- Patógenos humanos

- Patógenos animales

- Contaminantes de los alimentos

- Contaminantes ambientales

- Alérgenos

- Fármacos terapéuticos que requieren un estrecho seguimiento.

- Abuso de drogas

Una prueba de flujo lateral (LFT) es un ensayo simple, rápido y económico que puede detectar la presencia de antígenos o anticuerpos diana en una muestra líquida.1 Como tipo de inmunoensayo, la detección se basa en la unión de anticuerpos con su antígeno objetivo combinado con una reacción de detección para producir un resultado legible y a menudo visible.

Se hace referencia a las LFT mediante múltiples términos y abreviaturas, algunos de los cuales son intercambiables, dependiendo de si se hace referencia al proceso de prueba o al dispositivo utilizado y si la prueba detecta antígenos o anticuerpos. Los términos comunes se resumen en la Tabla 1 a continuación.

Tabla 1: Nombres y abreviaturas utilizadas para describir las LFT.

Término

Abreviatura

Comentarios

Prueba de flujo lateral

LFT

Puede referirse al proceso de prueba o al dispositivo físico.

Ensayo de flujo lateral

LFA

Puede referirse al proceso de prueba o al dispositivo físico.

Inmunoensayo de flujo lateral

LFIA

Puede referirse al proceso de prueba o al dispositivo físico.

Ensayo inmunocromatográfico de flujo lateral.

LFIA

Puede referirse al proceso de prueba o al dispositivo físico.

Dispositivo de flujo lateral

LFD

Se refiere al dispositivo de prueba física.

Tira reactiva inmunocromatográfica

-

Se refiere al dispositivo de prueba física.

prueba de antígeno

-

Puede referirse a cualquier prueba que detecte antígenos, como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), pero incluye LFT

prueba de anticuerpos

-

Puede referirse a cualquier prueba que detecte anticuerpos, como ELISA, pero incluye LFT

prueba rápida

-

Aunque técnicamente no es un término exclusivo para una LFT y podría abarcar otras modalidades de prueba, este término a menudo se utiliza para referirse a una LFT.

Prueba rápida de antígenos

RATA o ARTE

Generalmente se entiende como una LFT que detecta antígenos diana.

Prueba rápida de anticuerpos

RATA o ARTE

Generalmente se toma para referirse a una LFT que detecta anticuerpos objetivo.

Los LFT suelen estar alojados dentro de una carcasa de plástico con un pozo para la introducción de la muestra y una ventana a través de la cual se pueden ver las líneas de prueba y control.

Para realizar una LFT directa se procede de la siguiente manera (Figura 1):

En las Figuras 2 y 3 se muestran ejemplos de las reacciones de unión que ocurren en LFT directas para detectar un antígeno o un anticuerpo, respectivamente.

Como la mayoría de las pruebas producen un resultado visible con líneas que se desarrollan donde se captura el conjugado, con o sin el objetivo, muchas LFT se pueden leer a simple vista. Las pruebas exitosas con ensayos directos se indican por la presencia de la línea de control y un resultado positivo o negativo se indica por la presencia o ausencia de la línea de prueba (Figura 4). Otra forma de LFT, la prueba competitiva (que se analiza en la siguiente sección) requiere una interpretación diferente de los resultados. Aunque no se utiliza con frecuencia entre el público en general, es importante establecer qué tipo de prueba se está evaluando.

Es importante tener en cuenta que los resultados sólo deben interpretarse dentro del plazo estipulado para esa prueba específica. Si se leen demasiado pronto después de introducir la muestra, es posible que el resultado no haya tenido tiempo de desarrollarse por completo. Si se dejan demasiado tiempo después de la introducción de la muestra, las bandas pueden alterarse con el tiempo a medida que la reacción se deteriora o se desarrolla excesivamente.

Algunas pruebas también se pueden leer digitalmente utilizando un dispositivo de escaneo portátil o de mesa o un teléfono inteligente. Los primeros escáneres portátiles estuvieron disponibles comercialmente en la década de 2000.4 Para las pruebas que producen un resultado fluorescente en lugar de colorimétrico, es necesario un lector de algún tipo. Mientras que los dispositivos portátiles y los sistemas de teléfonos inteligentes normalmente leen una prueba a la vez, los dispositivos de mesa pueden leer lotes de LFD simultáneamente, pero normalmente están restringidos a entornos de laboratorio, a diferencia de sus homólogos portátiles. El uso de estos dispositivos puede eliminar la incertidumbre del error humano al leer, interpretar y, cuando corresponda, registrar los resultados. Algunos lectores también medirán la intensidad de las líneas de prueba para dar una forma de resultado cuantitativo. Las mediciones digitales pueden ser particularmente útiles cuando las líneas del LFD son débiles y tener un registro digital de los resultados de las pruebas puede ayudar con los problemas de trazabilidad e integridad de los datos. También ofrecen oportunidades para recopilar datos para el seguimiento de los pacientes por parte de los médicos, lo que podría conducir a intervenciones tempranas y mejores resultados de salud.

Si bien los lectores de mesa y portátiles no suelen ser prácticos ni asequibles para uso doméstico, los lectores de teléfonos inteligentes han llenado este vacío. Los primeros formularios no se adoptaron ampliamente debido a la necesidad de complementos personalizados adicionales5, 6, 7 para permitir que el teléfono capture los resultados. Sin embargo, los avances en la tecnología de análisis y telefonía junto con una mayor conectividad han mejorado esta situación. Durante la pandemia de COVID-19, se aprobó el uso de lectores digitales mediante los cuales los usuarios enviaban una foto del LFT a través de una aplicación en su teléfono y se utilizaba inteligencia artificial para interpretar el resultado. Los creadores esperan que la aplicación pueda utilizarse más ampliamente para otras pruebas basadas en LFD. A medida que la demanda de pruebas cuantitativas en los puntos de atención y de uso continúa aumentando y las tecnologías de sensores continúan mejorando y reduciendo su tamaño y costo, parece probable que sigamos viendo nuevos desarrollos tecnológicos en esta área.8

Las pruebas pueden diseñarse para detectar múltiples objetivos en una sola ejecución, lo que se conoce como multiplexación (que se analiza más adelante en la siguiente sección).9 En estos casos, los resultados para cada objetivo se pueden presentar como una única línea de control compartida con líneas de prueba secuenciales, cada una de las cuales de los cuales indicará si la muestra es positiva o negativa para su correspondiente objetivo (Figura 5 A). El mismo principio también se puede aplicar para crear un formato de matriz, donde se ejecutan en paralelo varias tiras reactivas, cada una para un solo objetivo y con sus propias líneas de control, y se leen los resultados en cada tira (Figura 5 B).

Alternativamente, se pueden usar sistemas que emplean múltiples etiquetas, cada una para un objetivo diferente en una sola muestra, que se pueden distinguir entre sí, como etiquetas fluorescentes con diferentes perfiles de emisión (Figura 6 A). Este enfoque requiere lectores especializados. Si es deseable detectar una clase completa de un objetivo determinado, en lugar de diferenciar el objetivo específico (por ejemplo, múltiples antígenos en un patógeno determinado o múltiples formas del mismo patógeno), se puede usar un anticuerpo ampliamente selectivo que detectará la presencia. de una variedad de moléculas en una clase determinada, pero lo informan como un único resultado indiferenciado (Figura 6B).

Como ocurre con la mayoría de los inmunoensayos, existen una serie de consideraciones importantes al desarrollar un LFT o transferir un ensayo de laboratorio a un LFD y es importante seleccionar y optimizar todos los componentes del ensayo con cuidado. Éstas incluyen:

La mayoría de las LFT que encontraremos, y de hecho el tipo descrito anteriormente, son ensayos directos; sin embargo, las LFT pueden estar en formato directo (sándwich) o competitivo (inhibición). Los ensayos directos se utilizan normalmente cuando se analizan analitos más grandes con múltiples sitios antigénicos, como la prueba de embarazo humano para gonadotropinas coriónicas humanas (hCG). En este caso, el conjugado debe estar en exceso para garantizar que, junto con el objetivo, no quede capturado en la línea de prueba y se le impida llegar a la línea de control.

Los formatos competitivos se utilizan normalmente cuando se analizan moléculas pequeñas con determinantes antigénicos únicos, que no pueden unirse a dos anticuerpos simultáneamente. A diferencia de los ensayos directos, un resultado positivo se indica por la ausencia de una línea de prueba, mientras que en todos los casos debería aparecer una línea de control. Esto se debe a que el conjugado ya está unido a antígenos diana purificados y solo cuando hay antígenos diana en la muestra se elimina el conjugado y se evita que se una y desarrolle un resultado en la línea de prueba (Figura 7).

Los anticuerpos monoclonales se unen a un único epítopo de su objetivo y, por tanto, proporcionan una buena especificidad. El uso de anticuerpos policlonales puede aumentar la sensibilidad, ya que se unirán a múltiples epítopos de la diana, a diferencia de los anticuerpos monoclonales, pero corren el riesgo de aumentar la unión no específica, lo que reduce la especificidad. Ya sea que se utilicen anticuerpos monoclonales o policlonales, cada anticuerpo debe validarse y optimizarse para un ensayo determinado, incluida la cantidad utilizada, para garantizar resultados precisos y sensibles.

Las lecturas ópticas se utilizan con mayor frecuencia en LFT y se pueden dividir en grupos colorimétricos y fluorescentes. La elección de la etiqueta conjugada correspondiente estará guiada por cómo se pretende leer la prueba, dónde y quién. Las etiquetas empleadas con más frecuencia en las pruebas colorimétricas incluyen oro coloidal, nanopartículas, celulosa y perlas de polímero, mientras que las etiquetas fluorescentes incluyen perlas fluorescentes10 y puntos cuánticos.11

La almohadilla de muestra1 debe poder absorber la muestra y liberarla en una forma que sea compatible con el LFD. Por lo tanto, debe ser suficientemente absorbente pero al mismo tiempo tener propiedades adecuadas para el tipo de muestra específico. Esto puede significar que sea necesario filtrar glóbulos rojos o partículas, cambiar el pH o alterar los componentes de la matriz, lo que se puede lograr mediante un tratamiento previo adecuado de la almohadilla.

La almohadilla de conjugado1 debe poder retener el conjugado y mantenerlo estable durante toda la vida útil del LFD, liberándolo de manera eficiente y confiable cuando se usa el LFD. El secado y la liberación deficientes o desiguales pueden ser fuentes importantes de variabilidad en el rendimiento del ensayo. Por lo tanto, es importante optimizar el material, el recubrimiento y el proceso de secado al cargar la almohadilla conjugada. También es importante que el material elegido no impida el flujo de la muestra.

La membrana1 debe poder permitir que la muestra/tampón y el conjugado fluyan consistentemente a través de ella y al mismo tiempo mantener los inmunorreactivos estables en las líneas de prueba y control durante toda la vida útil del LFD. Tampoco debe interferir con las reacciones de unión o la metodología de detección elegida. La nitrocelulosa es un material popular; Se han probado otros, pero en general con poco éxito.

El volumen que puede contener la membrana es finito y, por lo tanto, la función de la almohadilla absorbente1 es aumentar la cantidad de muestra y, por lo tanto, el objetivo, si está presente, que pasa a través de la membrana sobre la línea de prueba, mejorando la sensibilidad y especificidad de la prueba. Lo logra absorbiendo la muestra (y el tampón, si se usa) a medida que llega a ella, lo que hace que más atraviese la membrana. La almohadilla absorbente debe tener un volumen de lecho superior a la muestra/tampón que se va a analizar para poder retener el exceso de volumen hasta que se pueda leer el resultado sin permitir un reflujo que pueda interferir. Por tanto, es importante elegir el espesor, la densidad, la resistencia y el material correctos. La celulosa es una opción popular gracias a su capacidad de absorción.

La muestra en sí es una consideración importante en una LFT exitosa. Las muestras que son muy viscosas pueden no atravesar la membrana o causar obstrucciones que provoquen fallas en las pruebas, mientras que las muestras no homogéneas pueden producir resultados poco confiables. La concentración de la muestra también es una consideración importante. Los resultados demasiado diluidos y positivos pueden pasar desapercibidos, demasiado concentrados y pueden interferir con el rendimiento de la prueba. Por lo tanto, algunos tipos de muestras pueden necesitar tratamiento previo (p. ej., mucolíticos), separación (p. ej., extracción de suero de sangre completa) o dilución para que sean susceptibles de pruebas basadas en LFD y producir resultados que estén dentro del rango dinámico de la prueba.

Si bien puede ser suficiente detectar un único objetivo, algunas aplicaciones se benefician de la multiplexación para permitir la detección de múltiples objetivos o múltiples partes del mismo objetivo general en un ensayo. Esto evita la necesidad de repetir las pruebas en la misma muestra, reduciendo así el tiempo y el coste. Sin embargo, la inclusión de múltiples reacciones de prueba en un solo dispositivo puede aumentar la complejidad de la optimización del ensayo y es importante evitar la reactividad cruzada o la interferencia entre los diferentes objetivos. La separación espacial de múltiples líneas de prueba es una forma popular de multiplexar, aunque puede complicar la interpretación de los resultados, requerir más materiales y muestras y aumentar el tiempo para obtener resultados en comparación con un ensayo de un solo objetivo. Los formatos de matriz superan el problema de la optimización combinada, el tiempo de ejecución y la lectura de resultados muy espaciados, pero también requieren muchos más materiales y muestras. Las estrategias de multiplexación que emplean etiquetas diferenciables también suelen requerir lectores especializados para interpretar los resultados.

Hay una serie de fortalezas asociadas con las LFT que han llevado a su uso generalizado, sobre todo en aplicaciones como pruebas de embarazo y en la pandemia de COVID-19. Sin embargo, como ocurre con la mayoría de los ensayos, existen limitaciones asociadas12 a su uso, como se resume a continuación.

Fortalezas

Debilidades

Las aplicaciones de los LFT son tan numerosas y diversas que sería imposible cubrirlas todas aquí, pero a continuación se muestra una selección de las áreas de uso más populares.

Probablemente uno de los ejemplos más conocidos de LFT sea la prueba de embarazo casera. Existe desde la década de 198013 y detecta en la orina la hCG, producida por la placenta durante el embarazo. La sensibilidad ha aumentado a lo largo de los años y las pruebas ahora suelen proporcionar un resultado positivo entre 10 y 11 días después de la concepción.

La mayoría de las personas probablemente hayan experimentado de primera mano una o más LFT caseras de SARS-CoV-214. La mayoría de los dispositivos que la gente usa en casa están diseñados para detectar la presencia del virus en sí (es decir, ¿podrían ser infecciosos?) en lugar de detectar anticuerpos que indiquen exposición o vacunación. Como tales, están dirigidos a unirse a las partes antigénicas expuestas y accesibles del virus, como las proteínas de espiga, envoltura, membrana o nucleocápside.15

Aunque el SARS-CoV-2 puede ser el patógeno humano que primero nos viene a la mente cuando pensamos en las aplicaciones de las LFT para enfermedades infecciosas, también han resultado útiles para detectar una variedad de objetivos, incluidos los parásitos Plasmodium que causan la malaria, Mycobacterium tuberculosis, el agente causante de la tuberculosis,16 el virus de la hepatitis B17 y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).18

Tampoco es sólo la medicina humana la que se beneficia de las LFT. Además de las pruebas de preñez en animales, con este formato también se pueden realizar pruebas para detectar varios patógenos veterinarios. Es particularmente útil para los profesionales que trabajan fuera de la clínica o para los agricultores, cuidadores o propietarios que realizan pruebas. Esto incluye la peste porcina africana19 y los patógenos entéricos bovinos.20 Las pruebas de LFT fueron fundamentales para la erradicación de la peste bovina.21 Las pruebas en granjas también pueden ayudar a evitar que los patógenos en los animales productores de alimentos lleguen al consumidor. Sin embargo, ha habido críticas sobre la calidad de algunas pruebas ofrecidas para enfermedades como la rabia.22

Los contaminantes de los alimentos se presentan de muchas formas, desde patógenos y pesticidas hasta metales pesados ​​y toxinas. Un ejemplo de ello son las aflatoxinas, metabolitos secundarios producidos por Aspergillus flavus y Aspergillus parasiticus que se encuentran en alimentos a base de cereales, nueces y especias.23 Abarcan un grupo de compuestos químicamente relacionados, para los cuales se han desarrollado numerosas LFT, dirigidas a las toxinas. Debido a su pequeño tamaño, las LFT para las aflatoxinas suelen tener un formato indirecto. También se han desarrollado pruebas múltiples que detectan aflatoxinas junto con otras micotoxinas.24 Las especies de Salmonella son patógenos alimentarios comunes cuyo diagnóstico rápido puede ayudar a acelerar el tratamiento, identificar fuentes de contaminación y ayudar a prevenir una mayor propagación.25 La tecnología LFT ha ofrecido un medio para hacer esto utilizando tecnología de fagos para determinar aglutinantes efectivos para las tiras reactivas,26 incluso distinguiendo Salmonella Enteritidis viva de muerta.

La detección de contaminantes ambientales, incluidos pesticidas, bisfenol A (BPA) y metales pesados, es importante para proteger a las personas, los animales y el medio ambiente. Las soluciones de prueba portátiles permiten a los analistas identificar problemas y tomar medidas rápidas mientras están en el sitio. Se han desarrollado LFT capaces de detectar iones de mercurio27, cromo28 y cadmio29. El BPS, un compuesto preocupante que altera el sistema endocrino, también se puede detectar con esta tecnología y mostró resultados favorables en comparación con las pruebas de laboratorio.30 Los pesticidas organofosforados se pueden detectar utilizando LFT indirectas,31 mientras que una prueba para la detección simultánea de carbofurano y triazofos en agua también se ha desarrollado.32

Las personas con alergias deben tener cuidado y asegurarse de evitar los desencadenantes. Asimismo, los productores de alimentos, por ejemplo, también deben asegurarse de que los productos declarados como “libres de” realmente lo sean. Las LFT ofrecen una forma rápida y sencilla de mantener a las personas seguras y se han desarrollado para una gran cantidad de alérgenos comunes, incluidos el gluten,33 la caseína,34 la soja,35 la mostaza y varios frutos secos.36

Para algunos fármacos terapéuticos, existe un pequeño margen entre una dosis ineficaz, una dosis óptima y exceder los niveles seguros donde se pueden experimentar efectos adversos graves. Para garantizar que los pacientes permanezcan dentro del rango de dosis óptimo, se requiere una estrecha vigilancia y los diagnósticos complementarios, como las LFT, pueden proporcionarlo. La digoxina, un glucósido cardíaco utilizado para el tratamiento de la taquicardia, es uno de esos fármacos y los científicos han desarrollado una LFT que se puede leer usando una aplicación de teléfono inteligente para ayudar con el autocontrol y la dosificación del paciente.37

El análisis de orina, para el que los LFA son muy adecuados, sigue siendo uno de los métodos de prueba de drogas ilícitas más comunes en el Reino Unido y proporciona resultados rápidos en situaciones como pruebas en el lugar de trabajo o aplicación de la ley. También se ha desarrollado una prueba para cocaína que, a diferencia de las pruebas para muchas drogas de abuso que siguen un formato competitivo debido a su pequeño tamaño molecular, utiliza un formato no competitivo al emplear un material biomimético.38 Incluso se han desarrollado LFA que pueden detectar Δ9-tetrahidrocannabinol, cocaína, opiáceos y anfetaminas en el sudor de una huella dactilar.39

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